Description

Le laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Reims et la Plate-forme Régionale de Biologie Innovante, proposent de détecter la contamination mycoplasmique dans les cultures cellulaires par PCR temps réel. Cette analyse peut être demandée pour des contrôles de qualité de lignées cellulaires non infectées pour le diagnostic ou pour la recherche.

La contamination mycoplasmique des cultures cellulaires est un problème répandu dans les laboratoires, elle peut interférer avec plusieurs processus cellulaires : la syntèse d’hybridomes, la synthèse de protéines ou d’acides aminés, l’immunogénicité, la présence d’antigène sur les membranes, les cassures chromosomiques, la culture de virus, la production de virus et de produits biologiques, la croissance et la morphologie cellulaire, le métabolisme cellulaire.

Méthode

Le test utilisé est basé sur une lyse des cellules, suivie d’une PCR temps réel SYBR Green capable de détecter les 6 espèces de mycoplasmes les plus répandues en culture cellulaire : M. arginini, M. fermentas, M. hominis, M. hyorhinis, M. salivarium et M. orale (Cf bibliographie).

Les échantillons sont testés en duplicate. Chaque série inclut un contrôle positif et un contrôle négatif.

Conditions d’accès

Ce service est accessible à toutes les équipes du CHU de Reims et de l’IFR53 et à toute équipe extérieure qui en fera la demande.

Un formulaire de demande de détection de mycoplasmes est disponible par email (prbi@chu-reims.fr). Il permet d’identifier les équipes et le nombre d’échantillons à analyser, il doit être joint à l’envoi des échantillons.

Echantillons

Les échantillons doivent être transmis dans des microtubes stériles de 1,5 mL coniques à vis (sarstedt ou équivalent) à la PRBI accompagnés du formulaire de demande.

La réception des échantillons se fait de 8h00 à 17h00 du lundi au vendredi.

Conditions d’envoi :

• échantillons de produits de culture (milieu de culture, sérum de veau,…) : 1 mL à envoyer à température ambiante,
• lignées cellulaires non infectées : culot sec de 500 000 cellules congelées et à envoyer à –20°C,
• ADN extrait de produits de culture ou de lignées cellulaires infectées ou non à envoyer à –20°C ou à +4°C (protocole d’extraction fourni sur demande).

Résultats

Le test est réalisé une fois par mois (calendrier trimestriel disponible à la demande). Cependant, en cas de demande urgente, la PRBI  se réserve le droit de répondre dans la mesure de ses possibilités. Les résultats sont communiqués par email à l’équipe. Le résultat est qualitatif (détection de mycoplasmes : négative ou positive)

NB : la technique utilisée a une limite de détection de 100 fg d’ADN génomique (cf. bibliographie)

Prestations

La PRBI réceptionne les échantillons et les conserve jusqu’à l’analyse. L’analyse est effectuée par le personnel du laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Reims. Elle comprend la lyse, la PCR Temps réel en duplicate et la validation technique. Les résultats sont envoyés par email par la PRBI dans la semaine prévue de l’analyse. La gestion des demandes, les commandes de réactifs et la facturation sont effectuées par la PRBI.

Tarification

Pour les équipes du CHU de Reims dans le cadre de contrôle de qualité diagnostic, aucune contribution n’est demandée.

Pour participer à la maintenance des équipements et aux frais de réactifs et consommables, une participation financière de 5 € TTC par test est demandée aux autres équipes.

La facturation peut être immédiate, dans ce cas l’équipe demandeuse doit joindre aux échantillons et à la feuille de demande un bon de commande précisant le nombre d’échantillons à passer au prix de 5 €TTC l’échantillon.

Pour les équipes qui souhaitent une facturation différée, la PRBI enverra tous les trois mois un devis reprenant tous les échantillons passés dans le trimestre au prix de 5 €TTC, les équipes transmettront le bon de commande par courrier à la PRBI.

Sur le bon de commande, indiquer comme fournisseur le CHU de Reims et préciser les coordonnées de l’organisme débiteur.

Référence bibliographique

Rapid detection of Mycoplasma contamination in cell cultures using SYBR-Green-based-real-time Polymerase Chain Reaction. Yoko Ishikawa, Takaharu Kozakai, Hatsue Morita, Kaname Saida, Syuichi Oka, Yoshinori Masuo. In vitro Cell. Dev. Biol.- Animal 42:63-69, March and April 2006